A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
时代背景：目前正蔓延全球的新型冠状大肠杆菌病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个东欧国家和地区大流行，截至 2021 年 4 月末已随之而来最多 1.28 亿人染病，最多 280 500人丧命。当前，尚待可适当减低 COVID-19 无故率的治治疗法方法。我们研究成果了一种基本上的里药口服本品——欲求肺毒口服液 (RDS) 的潜在外用冠状大肠杆菌活官能，该口服液主要化学成分为和西方医学基本上里用做治治疗法肺疟疾的大豆。
结果：RDS 依赖官能 SARS-CoV 快大肠杆菌、SARS-CoV-2 快大肠杆菌、混和乙型大肠杆菌-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型大肠杆菌以及传染官能 SARS-CoV-2 和新创的 Ha-CoV-2 植物种大肠杆菌 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对生命体膜内的染病。我们更进一步事实证明 RDS 可以直接灭活 SARS-CoV-2 大肠杆菌微粒的传染官能。此外，我们注意到 RDS 还可截断乙型流行官能感冒大肠杆菌对生命体膜内的染病。
推论：RDS 可最常依赖官能呼吸食道大肠杆菌染病。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状大肠杆菌，外用大肠杆菌治治疗法，欲求肺毒口服液，基本上里药，SARS-CoV，乙型流行官能感冒，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型大肠杆菌
▋时代背景
目前正蔓延全球的新型冠状大肠杆菌病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个东欧国家和地区大流行，截至 2021 年 4 月末已随之而来最多 1.28 亿人染病，最多 280 500人丧命。当前，尚待可适当减低 COVID-19 无故率的治治疗法方法。新成现的 COVID-19 大肠杆菌病原体为冠状大肠杆菌 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重急官能呼吸食综合征具体冠状大肠杆菌大类里的姊妹大肠杆菌[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在里国注意到的；SARS-CoV 大肠杆菌于 2002 年 11 月末在广东省首次被注意到[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 月末在武汉首次被注意到[1,7,8]。在里国，这两次由冠状大肠杆菌激起的疫情里，里药均被最常运用于，用以紧急尽量避免冠状大肠杆菌激起的疟疾。对于当前的 COVID-19 大流行，里国有最多 85% 的 SARS-CoV-2 染病患者接受了基本上里医药治疗法（9，10）。许多运用于的里药应该具适当的外用冠状大肠杆菌功能官能并在针灸上应该适当，这个举足轻重难题仍未取得充分答复。
里药作为治治疗法冠状大肠杆菌所引发疟疾的适当治疗法，但由于忽视人体内或胃的的系统研究成果，其发展与合理运用于均受到了以致于。为了相符里药的潜在外用 SARS-CoV-2 活官能，我们从惯用里药里抽样了多种药材生命体碱，并从里药口服液 RDS(旧金山一种金融业官能食品补充剂) 里注意到了外用 SARS-CoV 和外用 SARS-CoV-2 大肠杆菌的活官能，一种在旧金山的金融业食品补充剂。RDS 用做增强人体肺的总体生活品质，其具体联多种药材化学成分，如大豆和益母草，它们是基本上上用做控制炎症和肺疟疾的大豆 (11-13)。在此，我们报道 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假大肠杆菌以及具染病官能的野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌对生命体膜内的染病具特异官能。我们更进一步证明 RDS 可通过直接灭活大肠杆菌微粒或迫使大肠杆菌侵入而依赖官能大肠杆菌的晚期染病施工进度。此外，我们注意到 RDS 还可以迫使甲流大肠杆菌对生命体膜内的染病。这些试验中中，RDS 对呼吸食道大肠杆菌的染病显然具最常的特异官能。
▋结果
为了从基本上大豆里找寻潜在的外用 SARS-CoV-2 活官能，我们从约四十种基本上药材里抽样所含有成 SARS-CoV-2S 蛋白假型快大肠杆菌[14,15] 和人体肺 A549(ACE2) 生命体膜内，此生命体 ACE2 基因才会通过快大肠杆菌转导作为媒介依赖官能，从而稳定转导来实现的大理解。快假型大肠杆菌运用于绿色红光蛋白 (GFP) 或红光以次酶 (Luc) 作为报道基因，并通过了具广谱外用大肠杆菌转到依赖官能剂，以及的兄弟多尔 (Arbidol)[16]，和生命体外用毒血清对外用 SARS-CoV-2(三幅 1a、C) 的正确官能。我们只能赢得成功侦测到的兄弟多尔 (Arbidol) 和外用毒血清对于 SARS-CoV-2 假型大肠杆菌的特异官能，这是我们在其他四十余种基本上药材生命体碱正确官能里没有注意到的，还包括其里一些假定极低刺激官能的药材 (三幅 1a-C)。然而，鉴于快官能假型大肠杆菌大部分能侦测 SARS-CoV-2 大肠杆菌的侵入行为，我们不能排除这些药材生命体碱显然有在转到后收尾只能依赖官能 SARS-CoV-2 的显然官能。我们更进一步从基本上类固醇欲求肺毒口服液 (RDS) 里抽样成了显然的外用 SARS-CoV-2 活官能，该的产品掺入九种药材化学成分——、苍耳、大豆、益母草、玄参、苦杏仁、蜂房、皂角、姜黄，在里国基本上上用做治治疗法肺疟疾 (11-13)。
掺入甲基咖啡盐酸、3，4-二邻咖啡酰基解毒剂盐酸、甲基 3，4-二邻咖啡酰基解毒剂盐酸、原儿茶盐酸、甲基绿原盐酸和青藤草以次；花蕾里还掺入氨酸 A、B 和 10 种目前为止环烯醚醇类氨酸[17]；该植物还掺入皂甙甙 A 和 B，以及外用炎症作用的氨酸 C[18,19]。苍耳甘油氨酸里掺入木脂以次、松脂丙酯苍耳氨酸[20]。大豆里掺入被称为大豆皂氨酸的甾体皂氨酸，是大豆属下植物都有的植物化学物质[21,22]。细叶益母草里主要活官能化学成分为四种单醇类，(−)-茴香酯、(+)-纳人口为120人酯、(−)-柠檬烯和 (+)-茴香呋喃；这种植物还掺入其他氧化物，如 1-辛烯-3-醇、3-辛酯、β-月末桂烯和β-卫矛烯[23]。玄参掺入最多 162 种氧化物，还包括环烯醚醇类和环烯醚醇类氨酸、苯丙氨酸、有机盐酸、醇类类、糖类、多酚、和皂氨酸[24]。苦杏仁里掺入酚类、氰基氧化物和果胶多糖[25]。皂角刺里掺入皂氨酸和羽扇豆盐酸[26,27]，而姜黄里掺入主要活官能化学成分姜黄盐酸[28]。为了更进一步正确官能 RDS 的外用 SARS-CoV-2 活官能，用不同乙醇沸点的 RDS 后附近理 A549(ACE2) 细胞内，然后让这些细胞内在假定 RDS 的情形接受 4-6 同一星期的染病。染病后，在不假定 RDS 的情形人才培养细胞内，然后在 48 和 72 同一星期的时候，通过流型式细胞内绝技对大肠杆菌染病的特异官能开展假设。为了控制细胞内刺激官能，运用于氰丙啶 (PI) 对即将丧命和已丧命的细胞内开展切片，大部分在活细胞内群里假设 GFP+细胞内。如三幅 2 上图，我们通过观察到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假大肠杆菌具口服一般来说特异官能。为了证明这些结果，我们运用于内源官能理解 ACE2 的 VeroE6 细胞内重复使用了该染病物理。
(见下页三幅)
ACE2 内外理解，生产官能 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 大肠杆菌可对其开展染病，ACE2 通惯用做冠状大肠杆菌的研究成果 (7)。尽量避免在忽视 ACE2 的大理解 [15，29，30] 的情形，假型大肠杆菌对 VeroE6 的染病官能较低，我们还运用于了红光以次酶报道基因假型大肠杆菌，该大肠杆菌的报道基因理解由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，具更高的报道基因危险官能和准确官能。
三幅 2：RDS 依赖官能 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌染病 A549(ACE2) 细胞内。
A.A549(ACE2) 细胞内用 RDS 倒数乙醇 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌染病。将细胞内沾去大肠杆菌和 RDS，并在不假定 RDS 的情形开展人才培养。流型式细胞内璇侦测大肠杆菌染病依赖官能情形。未染病的细胞内和染病 SARS-CoV-2(GFP) 但未经 RDS 治治疗法的细胞内作为印证。GFP+细胞内百分比已显示。(PI) 氰丙啶。
B.RDS 的细胞内刺激官能的系统官能。A549(ACE2) 细胞内用 RDS 倒数乙醇 4 同一星期，沾去 RDS，无 RDS 人才培养 48 同一星期。氰丙啶切片鉴定正在丧命细胞内和已丧命细胞内，流型式细胞内绝技假设。描画口服-反应才会细胞内刺激官能弧线，RDS 的半无故沸点 (LC50) 数量为 1:11.9。
如三幅 3A 上图，我们运用于 Luc 报告基因假大肠杆菌和 VeroE6 细胞内开展染病物理，通过观察到 RDS 对该大肠杆菌染病具口服一般来说特异官能，并且分之三依赖官能沸点相符为 1:230RDS 乙醇度 (三幅 3B)。我们还假设了 RDS 对 VeroE6 细胞内活力的影响，相符了 50% 细胞内丧命口服为 1:11.8RDS 乙醇度。
三幅 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假大肠杆菌和野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌的口服一般来说依赖官能特异官能。用 RDS 倒数乙醇后附近理 A、BVeroE6 细胞内，并用 SARS-CoV-2(Luc) 假型大肠杆菌染病。将细胞内沾去大肠杆菌和 RDS，并在不假定 RDS 的情形开展人才培养。在染病后 72 同一星期用红光以次酶侦测大肠杆菌染病的特异官能。未染病细胞内和 SARS-CoV-2-luc 染病但未经过 RDS 治治疗法的细胞内作为印证。物理重复使用三次。描画口服反应才会弧线和 RDS 的 I-C50 乙醇数量为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞内的细胞内刺激官能也通过氰丙啶切片和流型式细胞内绝技的系统官能。用 RDS 倒数乙醇 4 同一星期，沾去 RDS，在不含有 RDS 的情形人才培养 72 同一星期。描画细胞内刺激官能口服-反应才会弧线，RDS 的半无故沸点 (LC50) 数量为 1:13.8 乙醇。DRDS 依赖官能传染官能 SARS-CoV-2 染病。用倒数乙醇的 RDS 后附近理 VeroE6 细胞内，并在 RDS 假定的情形染病 SARS-CoV-2。染病 48 同一星期后，通过血菌斑假设大肠杆菌获释后的大肠杆菌拷贝依赖官能情形。依赖官能试验中一型式三份开展，并在 Prism7(Graph Pad) 里运用于单向权重 (One-Way ANOVA) 假设及 Dunnett 后检查 (Dunnett's Post Test)，意在相符统计显着官能。很大官能值用则有表示如下：*p
为了更进一步正确官能运用于假大肠杆菌赢得的结果，我们正确官能了 RDS 对于 SARS-CoV-2 染病的截断传染官能意志力。如三幅 3D 上图，RDS 同时也截断了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞内的染病。RDS 在乙醇 1:40 以上时可很大减少大肠杆菌黑斑的逐步形成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假大肠杆菌与传染官能大肠杆菌的试验中中，RDS 掺入依赖官能 SARS-CoV-2 染病的活官能化学成分，显然是通过直接灭活大肠杆菌或截断大肠杆菌的晚期染病施工进度。
为更进一步研究成果显然的机制，我们将传染官能 SARS-CoV-2 大肠杆菌微粒与倒数乙醇的 RDS 在 37°C 下预人才培养 1 同一星期。随后，将混和物更进一步依次乙醇-(10–1 至 10–4)，并转入 Vero 细胞内开展血菌斑假设以相符大肠杆菌染病官能的减低。如三幅 4A 上图，我们通过观察到在 RDS 里短暂暴露一同一星期后的大肠杆菌微粒，其 SARS-CoV-2 的染病效价也呈口服一般来说攀升。该结果事实证明 RDS 可适当直接灭活 SARS-CoV-2 大肠杆菌微粒的传染官能。
我们更进一步正确官能了 RDS 应该也能依赖官能 SARS-CoV-2 大肠杆菌植物种的染病。为此，我们利用最近开发新的混和甲大肠杆菌-SARS-CoV-2 假型大肠杆菌 (Ha-CoV-2)[31] 来高纯度一系列 S 蛋白举例来说，还包括苏格兰举例来说 (B.1.1.7)，南非举例来说 (B.1.351)，巴西举例来说 (P.1)，另加州举例来说 (B.1.429)，和其他几个新兴举例来说 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和具体 S 蛋白基因突变体在 37°C 倒数乙醇 RDS 人才培养 1 同一星期。随后，用该混和物染病 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 生命体膜内。染病后 12 同一星期，红光以次酶测量大肠杆菌染病的特异官能。如三幅 4B 上图，我们还通过观察到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 蛋白举例来说的口服一般来说依赖官能。
我们还正确官能了 RDS 截断 SARS-CoV 染病的意志力，运用于带有 SARS-CoV 突刺蛋白的 GFP 报道基因快大肠杆菌和[15] 伪口服。我们将人 A549(ACE2) 细胞内用以生命体膜内，将其用系列乙醇的 RDS 后附近理，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假大肠杆菌染病 4-6 同一星期。染病后在不含有 RDS 的情形人才培养细胞内，流型式细胞内绝技假设侦测其对大肠杆菌染病的特异官能。同样，运用于氰丙啶排除正在丧命与已丧命的细胞内，大部分在活细胞内群里假设 GFP+细胞内。如三幅 5A 上图，我们通过观察到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型大肠杆菌的特异官能呈口服一般来说。我们更进一步事实证明这些结果，并假设了 RDS 依赖官能的依赖官能与 Luc 报道基因 SARS-CoV 假型大肠杆菌，SARSCoV(Luc)。我们通过观察到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的特异官能呈口服官能依赖，其半依赖官能沸点 (IC50) 为 1:70.88 乙醇度 (三幅 5B，C)。尽量避免 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都运用于 ACE2 染病生命体膜内，我们还正确官能了 RDS 的外用大肠杆菌活官能应该大部分针对与 ACE2 有相互作用的冠状大肠杆菌。为此，我们侦测了一种不具体的负链 RNA 大肠杆菌--乙型流行官能感冒大肠杆菌。它通过大肠杆菌血凝以次 (HA) 和细胞内α-唾液盐酸来染病生命体膜内。为了高纯度乙型流行官能感冒大肠杆菌，将理解乙型流行官能感冒 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个片段的 8 个媒介和一个 GFP-报道基因共转染到 HEK293T 细胞内里。在 RDS 假定的情形，查阅大肠杆菌微粒并用做染病期望 MDCK 细胞内。如三幅 6A 上图，我们通过观察到 RDS 对乙型流行官能感冒大肠杆菌的特异官能呈口服一般来说。RDS 在 1:40 和 1:80 乙醇时可完全截断大肠杆菌染病，在 1:160 乙醇人口为120人可部分依赖官能乙型流行官能感冒。RDS 对 MDCK 细胞内的半无故沸点 (LC50) 经测量为 1:18.5(三幅 6B)。这些试验中中，RDS 的外用大肠杆菌活官能并非针对特定大肠杆菌，而显然只能最常依赖官能多种呼吸食道大肠杆菌，如冠状大肠杆菌和乙型流行官能感冒大肠杆菌。
▋发表意见
在本报告里，我们事实证明基本上类固醇欲求肺毒口服液 (RDS) 掺入广谱外用大肠杆菌活官能，可截断 SARS-CoV、SARSCoV-2 和乙型流行官能感冒大肠杆菌的染病。虽然 RDS 只能依赖官能多种大肠杆菌，但其外用大肠杆菌活官能因大肠杆菌类型和病刺激官能而异。例如，对 SARS-CoV 快假大肠杆菌的 I-C50 沸点为 1:7.9 乙醇度，对 SARS-CoV-2 快假大肠杆菌的 I-C50 沸点为 1:230 乙醇度。对于传染官能野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌，I-C50 为 1:40 乙醇度，对乙型流行官能感冒，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其植物种有不同的特异官能，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 乙醇度不等 (三幅 4B)。
(见下一页三幅)
三幅 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和新创的 Ha-CoV-2 植物种具口服一般来说灭活作用。ASARS-CoV-2 微粒另加倒数乙醇的 RDS 在 37°C 下人才培养 1 同一星期。随后，将混和物更进一步倒数乙醇，并转入 Vero 细胞内里开展血菌斑假设，以相符大肠杆菌染病官能减低。依赖官能试验中一型式三份开展，并在 Prism7(GraphPad) 里运用于单向权重 (One-WayANOVA) 假设和 Dunnett 后检查 (Dunnett'sPostTest) 意在相符统计显着官能。很大官能值用则有表示如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和具体 S 蛋白举例来说与倒数乙醇的 RDS 在 37°C 人才培养 1 同一星期后，用混和物染病 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 生命体膜内。染病后 12 同一星期，红光以次酶测量大肠杆菌染病的特异官能。RDS 的 IC50 值的乙醇度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们更进一步事实证明 RDS 可以依赖官能冠状大肠杆菌的晚期染病施工进度。虽然具体的外用大肠杆菌机制仍未明了，但 RDS 可以通过直接灭活大肠杆菌微粒或通过迫使大肠杆菌侵入或截断大肠杆菌侵入后的晚期施工进度来迫使大肠杆菌染病。在其他几种基本上里药里也注意到了外用 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活官能。例如，一种常见的基本上里药——姜黄。
姜黄根里已证明掺入姜黄盐酸以次，可依赖官能 SARS 大肠杆菌[32] 针灸剥离株的拷贝。此外，另一种可用做治治疗法呼吸食道疟疾的里药——双黄连本品，已显示成在胃以口服一般来说方型式将依赖官能 SARS-CoV-23CL 酶活官能 (3CLpro) 活官能。悬钩子氨酸和悬钩子以次拟作为双黄连截断 3CLpro[33] 的适当化学成分。
三幅 5 RDS 依赖官能 SARS-CoV 假型大肠杆菌对 A549(ACE2) 细胞内的染病。用倒数乙醇的 RDS 后附近理 A、B 细胞内，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型大肠杆菌染病。将细胞内清除，去掉大肠杆菌和 RDS，在不假定 RDS 的情形开展人才培养。在染病后 48 同一星期和 72 同一星期，通过流型式细胞内绝技或红光以次酶侦测来的系统官能大肠杆菌染病的特异官能。物理重复使用三次。描画口服自发弧线，并描画 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 乙醇度 (C)
三幅 6 RDS 依赖官能甲流大肠杆菌对 MDCK 细胞内的染病。(A) 用倒数乙醇的 RDS 后附近理 MDCK 细胞内 30 分钟，然后用甲流大肠杆菌 (GFP) 对其开展染病。染病后，在 RDS 假定下人才培养细胞内。36 同一星期后用流型式细胞内璇对大肠杆菌染病的特异官能开展的系统官能。把未染病的细胞内与被甲流大肠杆菌 (GFP) 染病但未经 RDS 附近理的细胞内开展对比。三幅里显示了 GFP+细胞内的百分比。PI 表示氰丙啶 PI。
(B) 另外还运用于了 MTT 测量法的系统官能了 RDS 对 MDCK 细胞内的刺激官能，描画了细胞内刺激官能的口服-反应才会弧线，经测算，RDS 的分之三无故沸点为 1:18.5 乙醇度 RDS 的适当外用大肠杆菌化学成分仍未相符。然而，RDS 不同于悬钩子氨酸和悬钩子以次，RDS 可以通过直接灭活大肠杆菌中微子来截断大肠杆菌染病 (三幅 4)，而悬钩子氨酸和悬钩子以次则在大肠杆菌生命周期的中期通过截断大肠杆菌酶活官能的活官能来意味著。然而，RDS 的胃外用 SARS-CoV-2 活官能仍须要在今后的动物研究成果和生命体针灸试验中里取得证明。目前，我们正在开展小型动物物理，以相符 RDS 在人体内截断 SARS-CoV-2 大肠杆菌染病的前瞻官能。
▋推论
我们的研究成果表明，RDS 可最常依赖官能呼吸食道大肠杆菌的染病，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和乙型流行官能感冒。
▋方法
细胞内和细胞内人才培养
HEK293T (ATCC 佩拉米尔，特拉华州) MDCK (ATCC 佩拉米尔，特拉华州)，VeroE6 (ATCC 佩拉米尔，特拉华州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 获赠，佩拉米尔，特拉华州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 获赠，佩拉米尔，特拉华州) 目前复原于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific) 掺入 10% 热和灭活 FBS 和 1×头孢菌以次-链霉以次 (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞内人才菌落里分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的沸点转入嘌呤霉以次和潮霉以次 B。
质粒转染和大肠杆菌高纯度
含有 SARS-CoVS 蛋白或 SARS-CoV-2S 蛋白的快官能假型大肠杆菌微粒由 Virongy LLC (Manassas，VA) 给予，或按照末尾刻画的方法[15] 高纯度。简言之，为了高纯度 GFP 报道基因快官能假大肠杆菌，HEK293T 细胞内与理解 SARS-CoVS 蛋白或 SARS-CoV-2S 蛋白的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了产成红光以次酶报道基因快官能假型大肠杆菌，将 HEK293T 细胞内与理解 SARSCoVS 蛋白或 SARS-CoV-2S 蛋白的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 开展共转染。转染后 48 同一星期查阅大肠杆菌上清液，离心油脂，−80℃ 复原。野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 给予。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因质粒和 A/WSN/1933 H1N1 新创质粒 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi Dr友好给予。在流行官能感冒大肠杆菌 A-GFP 报道基因中微子高纯度里，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 细胞内 (ΔAT6)。48 同一星期后查阅大肠杆菌上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 理解媒介购自 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 媒介和 S 蛋白基因突变媒介。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 蛋白基因突变中微子按照末尾刻画方法[31] 开展高纯度。
大肠杆菌染病和类固醇依赖官能试验中
RDS(欲求肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 获赠，利斯堡，特拉华州) 是由马Dr物理室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种金融业的产品。RDS 里所有大豆化学成分均适用《里国原产地 2015 年版》「饮片」准则，还包括适当化学成分含有量及油渍、药剂附赠侦测。RDS 是一种里药的共煎剂，事与愿违游离在真空必须要下蒸发。SARS-CoV-2 外用血清由 LanceA. Liotta 医生给予。将的兄弟朵尔盐苯甲酸 (Sigma) 重新悬浮在二甲基亚砜 (Sigma) 里。对于假型大肠杆菌染病，12 孔板里的 A549(ACE2) 细胞内 (来自 Virongy LLC 获赠，佩拉米尔，特拉华州) 或 VeroE6 细胞内用 RDS 后附近理 30 分钟，在 37℃ 下染病 4-6 同一星期，然后在新鲜人才菌落里沾涤人才培养 48-72 同一星期。对于 VeroE6 细胞内的染病，细胞内也被 CoV-2 假型大肠杆菌染病增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 获赠，佩拉米尔，特拉华州) 后附近理后，在 37°C 下再附近理 30 分钟。运用于 GloMaxDiscover 酶标璇 (Promega) 假设细胞内裂解物的红光以次酶活官能。对于野生型 SARS-CoV-2 染病，VeroE6 细胞内在 37°C 下用 RDS 后附近理 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 染病 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在弗雷德里克史密斯国立大学的 BSL-3 转送设施内停留 1 同一星期。细胞内用 PBS 沾涤 2 次，用含有 RDS 的人才菌落人才培养 48 同一星期。从上清里所含有大肠杆菌，用 12 孔板人才培养的 Vero 细胞内单层里的血菌斑试验中测量小瓶滴度。简言之，每个样本在比较简单的 Dul-becco's ModifiedEagle 人才菌落 (VWR) 里高纯度，具体联 1X 头孢菌以次-链霉以次 (VWR)，并添另加 10% 的 FBS(赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种乙醇液吸食附到 VeroE6 细胞内单层的三个并行孔上 1 同一星期。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一部分比较简单的 Eagle Minimal Essential 人才菌落 (VWR) 的混和物覆盖单层，含有 1X 头孢菌以次-链霉以次，并添另加 10%FBS。48 同一星期后，将单层内层通常在 10% 甲醛溶液里 1 同一星期，并去除覆盖的琼脂塞。为了切片黑斑，转入掺入 20% 乙醇的 1% 固体紫树脂溶液 5 分钟，然后用去离子水沾涤。对于乙型流行官能感冒大肠杆菌染病 MDCK 细胞内，在 37°C 下用 RDS 后附近理 30 分钟，然后用 A-GFP 报道基因大肠杆菌染病 6 同一星期。用含有 RDS 的人才菌落沾涤细胞内，人才培养 36 同一星期。GFP 理解通过流型式细胞内璇的系统官能。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 大肠杆菌微粒的 RDS 灭活试验中，将 100μl 倒数乙醇的 RDS 添另加到 1 mlSARS-CoV-2 大肠杆菌原液 (3.65×105PFU/ml) 里，事与愿违 RDS 乙醇为 1:20，1:40 或 1:80。也还包括印证必须要 (1 ml 大肠杆菌+100μl 人才菌落)。混和物在 37°C 下人才培养 1 同一星期。随后，对混和物开展系列乙醇以消除额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 乙醇度，并将倒数乙醇的样本转入 12 孔板里的 Vero 细胞内里，用做开展血菌斑测量假设。黑斑测量里事与愿违的 RDS 乙醇度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 乙醇液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 蛋白基因突变中微子按照末尾刻画的方法[31] 高纯度。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 倒数乙醇的 RDS 添另加到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或举例来说里，事与愿违 RDS 乙醇度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将混和物在 37°C 下人才培养 1 同一星期，然后在 RDS 假定下染病 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞内 12 同一星期。运用于 GloMax Discover 酶标璇 (Promega) 假设细胞内裂解物的红光以次酶活官能。
细胞内刺激官能假设侦测
用氰丙啶切片和流型式细胞内绝技假设对 A549 (ACE2) 细胞内和 VeroE6 细胞内的类固醇细胞内刺激官能开展侦测，如所述 (34)。运用于细胞内增殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和公司提议的提案对 MDCK 细胞内的类固醇刺激官能开展假设。简言之，将 MDCK 细胞内 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞内的速度接种到 12 孔板里。细胞内人才培养隔夜后，通过 RDS 附近理 1 天，然后在 MTT 标明试剂 (Sigma) 的人才菌落里人才培养。将细胞内与标明试剂共同人才培养 4 同一星期，再后续转入 MTT 增溶液。人才培养皿孵育清早，用 GloMax Discover 酶标璇 (Promega) 测量吸食恒星。
简写
SARS-CoV：严重急官能肺综合症具体冠状大肠杆菌；SARSCoV-2：Severe 严重急官能肺综合症具体冠状大肠杆菌-2；TCM：基本上里药；RDS：呼吸食道排毒口服液；Ha-CoV-2：混和乙型新冠大肠杆菌假大肠杆菌。
致谢
感恩 FengLi 给予流行官能感冒大肠杆菌理解媒介，感恩 LanceLiotta 给予外用毒血清；感恩 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的发表意见与提议；感恩 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 给予 RDS 和药材生命体碱。
译者贡献
此次物理由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该物理。所有译者已写出并批准后事与愿违稿件。
资金
本研究成果的经费来自于弗雷德里克史密斯国立大学内外款项 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 给予。
原始数据和材料的可用官能
本研究成果里消除或假设的所有原始数据均具体联在本文里。试剂可从 Y.W 附近换取。
声明
批准后及参与同意
不适用
同意成版
不适用
竞争利益
弗雷德里克史密斯国立大学东欧国家生命体防御和结核病里心的 RMH 和 YW 已赢得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究成果资助，LAH 为德佳和畅担任主管并赢得了款项。没有其他的关系或活动显然才会影响到提交的实习。
译者详细信息
1旧金山特拉华州弗雷德里克史密斯国立大学的系统生命体学医学院东欧国家生命体防御和结核病里心，佩拉米尔 20110。
2VirongyLLC，特拉华州佩拉米尔。3另加拿大伯纳比，BCV5J0E5 马Dr物理室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 旧金山特拉华州利斯堡世界卫生科学组织，20176。
收稿订于：2021 年 4 月末 7 日
接受订于：2021 年 5 月末 10 日
线上成版星期：2021 年 5 月末 29 日
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编辑： 翟的大男相关新闻
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